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实验三 叶绿体色素的提取、分离和性质分析

时间:2010-12-04


实验三 叶绿体色素的提取、分离、性质及含量

一、实验目的
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掌握叶绿体色素的提取方法;
掌握纸层析法分离叶绿体色素的原 理和步骤; 掌握叶绿体色素的部分理化性质。

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二、实验原理
(一)叶绿体色素: 叶绿素a 1.叶绿素 叶绿素b

2.类胡萝卜素

胡萝卜素
叶黄素

(二)四种色素的化学性质
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均为亲脂性>亲水性:
均不溶于水,而溶于有机溶剂,故可用乙醇、 丙酮等有机溶剂提取。

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极性大小: 叶绿素b>叶绿素a>叶黄素>胡萝卜素

根据相似相溶原理,在有机溶液中的溶解度:
叶绿素b<叶绿素a <叶黄素<胡萝卜素

叶绿素的卟啉环:
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叶绿素分子头部的金属卟啉环中心均为Mg2+。 在弱酸作用下,叶绿素分子中的镁可被H + 取 代而形成褐色的去镁叶绿素,后者遇铜则可形 成绿色的铜代叶绿素。 铜代叶绿素很稳定,在光下不易被破坏,故常 用此法制做植物的原色标本。

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(三)叶绿素的光学性质
叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性,表现出一定 的吸收光谱,可用分光光度计精确测定。
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叶绿素的荧光现象
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叶绿素溶液在透射光下呈绿色,而反射光下呈红色的现 象。

三、实验材料与试剂
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新鲜的菠菜叶片。
95%乙醇 、CaCO3、醋酸铜结晶、浓 盐酸、汽油。 量筒,滤纸,大培养皿一只,小培养皿 一只,长滴管,剪刀。

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四、实验步骤
1、 叶绿体色素提取: 将菠菜叶片擦净,去中脉后取 10g剪碎,加少许碳酸钙和石英砂, 再分次加入10mL酒精研磨,过滤,定容至50ml,分装于5个试管内, 容量分别为10ml。
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1

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2、叶绿体色素的分离——(纸层析法)
用滤纸条浸色素提取液(试管1),吹干,反复多 次;将带色素的滤纸条卷成灯芯,将表面皿放在培养 皿内,注上汽油,把灯芯浸在汽油内,加盖,色素层 分清后,取下吹干,即可看到分离的各种色素。

? 标明各层成 分名称和判 断依据。

3、叶绿体色素吸收光谱曲线
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取1ml提取液于比色杯中(试管2),加3ml95%乙醇。 用95%乙醇作为对照,在400~700nm之间每隔20nm测一次 光。

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记录波长和吸光度A于下表中,并在标准绘图纸上绘出叶绿体色 素的吸收光谱曲线。

λ 400 420 440 460 480 500 …... 600 620 640 660 680 700 (nm) A

4、叶绿体色素含量的计算
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在标准曲线上查出波长600nm时的叶绿 体色素浓度。
叶绿体色素含量(mg· g-1)=
叶绿体色素浓度(mg· L-1)×提取液体积(mL)×10-3 样品鲜重(g)

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5、叶绿素提取液荧光现象观察
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取试管3:

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从与入射光垂直的方向观 察;
再在透射光方向观察叶绿 体色素溶液的颜色; 记录叶绿素体色素溶液颜 色有何不同 ,分析原因。

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6、光对叶绿素的破坏作用
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将试管4置于暗处,试管3置于强光 下,照射2~3小时后,观察试管颜 色的变化,解释这种现象。

7、铜代叶绿素反应
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向试管5中逐滴加入浓盐酸,并不断摇匀,至颜色变化, 观察并记录现象;
向变色后的叶绿素溶液中加入少量醋酸铜,并在酒精 灯上缓缓加热,观察并记录颜色的变化。 分析原因。

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五、注意事项
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分离色素用的圆形滤纸,在中心打 的小圆孔,周围必须整齐,否则分 离的色素不是一个同心圆。
每次改变波长后,要用95%乙醇重新调 零。

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六、实验结果
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画图说明叶绿体色素纸层析结果,并解释原因。
在标准绘图纸上绘出叶绿体色素的吸收光谱曲 线并计算色素含量。 解释叶绿素的荧光现象。 解释光对叶绿素的破坏作用现象。

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解释叶绿体色素分子的替代作用现象。

七、思考题:
1、用不含水的有机溶剂如无水乙醇、无水丙酮等 提取干燥材料中的叶绿体色素,结果会如何?为什么? 2、研磨提取叶绿素时,为何要加入CaCO3? 3、铜在叶绿素分子中具有替代镁的作用,这有何 实用意义?


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