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[成都七中生物奥赛培训生化]第11章 基因工程_图文

时间:2015-09-10

第十一章

基因重组和基因工程
Genetic Recombination and Genetic Engineering

Dr.Qiang Fu. Dept.of Biochemistry & Molecular Biology, Preclinical Medicine School, SCU, 2014. 12

第一节

细胞内的DNA重组
DNA Recombination

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DNA重组
同源重组 (homologous recombination)

接合作用 (conjugation)
转化作用 (transformation) 转导作用 (transduction) 位点特异的重组(site-specific recombination) 转 座 (transposition)

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一、同源重组
发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination) ,又称基本重组。 是最基本的 DNA 重组方式,通过链的断裂和 再连接,在两个 DNA 分子同源序列间进行单 链或双链片段的交换。 以 E.coli 的同源重组为例,了解同源重组

机制的Holliday模型。
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Holliday模型中,同源重组主要4个关键步骤 ①两个同源染色体DNA排列整齐 ②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA 对应的链连接,形成Holliday中间体 ③通过分支移动产生异源双链DNA

④Holliday中间体切开并修复,形成两个双链 重组体DNA,分别为:
片段重组体(patch recombinant) 拼接重组体(splice recombinant)
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片段重组体 (见模型图右边产物): 切开的链与原来断裂的是同一条链,重组 体含有一段异源双链区,其两侧来自同一亲本 DNA。 拼接重组体(见模型图左边产物): 切开的链并非原来断裂的链,重组体异源 双链区的两侧来自不同亲本DNA。

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5? 3? 3? 5? 5? 3? 3? 5?

3? 5? 5?

内切酶

3? (recBCD)
3? 5? 5? 3?

5? 3? 3? 5?

3? 5? 5? 3? 5? 3?

DNA侵扰 (recA)
5? 3? 3? 5? 3? 5? 5? 3?

分支迁移

(recA)

内切酶 (recBCD)

5? 3? 3? 3?

3? 5? 5? 3?

DNA 连接酶

5? 3? 3? 5?

Holiday中间体

3? 5? 5? 3?

5? 3? 3? 5?

Holiday中间体 内切酶 (ruvC)
3? 5? 3?

3? 5? 5? 3? 5? 3? 5?

3? 5? 5? 3? 3? 5?

内切酶 (ruvC)
5? 3?

3?

5?

5? 3?

拼 DNA 接 连接酶 3? 5? 重 5? 组 3? 体
5? 5?3? 3?

3?

片 段 重 组 体
5? 3?

5? 3? 5? 3?

5?

3?

DNA 连接酶 3?

5?

5?

5?

3?

二、细菌的基因转移与重组
(一)接合作用
当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接 触时,质粒DNA从一个细胞(细菌)转移至

另一细胞(细菌)的DNA转移称为接合作用
(conjugation)。

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质粒 —— 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子 可接合质粒如 F 因子(F factor)

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(二)转化作用

通过自动获取或人为地供给外源 DNA , 使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型, 称为转化作用 (transformation)。

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例:溶菌时,裂解的DNA片段被另一细菌摄取。

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(三)转导作用
当病毒从被感染的(供体)细胞释放出
来、再次感染另一(受体)细胞时,发生在 供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因 重组即为转导作用(transduction)。

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例 λ噬菌体的生活史 溶菌生长途径 (lysis pathway) 溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)

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三、位点特异重组
位点特异重组 (site-specific recombination)
是由整合酶催化,在两个DNA序列的特异位点

间发生的整合。

例 (一)λ噬菌体DNA的整合
λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色

体的特异靶位点发生选择性整合;反转录病
毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒 cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。
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例(二)细菌的特异位点重组
沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变

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hix为反向重复序列,它们之间的H片段 可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H 片段上有两个启动子P,其一驱动hin基因表 达,另一正向时驱动H2和rH1基因表达,反 向 ( 倒位 ) 时 H2 和 rH1 不表达。 rH1 为 H1 的阻 遏蛋白基因。

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沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变 DNA 启动序列 启动序列 I H1

hin

H2 H2鞭毛素

Hin重组酶

阻遏蛋白 H2 I H1 H1鞭毛素
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hin
转位片段

例(三)免疫球蛋白基因的重排
免疫球蛋白 (Ig) ,由两条轻链 (L 链 ) 和两 条重链(H链)组成,分别由三个独立的基因族 编码,其中两个编码轻链 (? 和 ? ) ,一个编码 重链。 轻链的基因片段:
L V J C

重链的基因片段:
L V D J C

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CACAGTG(12/23)ACAAAAACC GTGTCCAC TGTTTTTGG
基因片段 重组信号序列

重链 (IgH) 基因的 V-D-J 重排和轻链 (IgL) 基 因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的 下游,J片段的上游以及D片段的两侧均存在保 守 的 重 组 信 号 序 列 (recombination signal sequence, RSS) 。 此 重 排 的 重 组 酶 基 因 rag (recombination activating gene)共有两个,分别 产生蛋白质RAG1和RAG2。
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免 疫 球 蛋 白 基 因 重 排 过 程

间插DNA V片段 RSS
单链切开 OH OH 分子内转酯反应

RSS
RAG1 RAG2

J片段

单链切开 转移核苷酸 修复、连接

V

J

四、转座重组

由插入序列和转座子介导的基因移位或 重排称为转座(transposition)。

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(一)插入序列转座
插入序列(insertion sequences, IS)组成: 二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列 特有的正向重复序列 一个转座酶(transposase)编码基因
IR Transposase Gene IR

发生形式: 保守性转座(conservative transposition) 复制性转座(duplicative transposition)
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插 入 序 列 的 复 制 性 转 座

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(二)转座子转座
转座子(transposons) ——可从一个染色体位 点转移到另一位点的分散重复序列。 转座子组成:反向重复序列 转座酶编码基因 抗生素抗性等有用的基因
IR Transposase Gene
有用基因 IR

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由转座子介导的转座

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第二节 重组DNA技术
DNA Recombination Technique

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重组DNA技术的发展史
1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工 程公司,专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉

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本节主要内容
?

相关概念
? ? ?

DNA克隆 工具酶 目的基因

?

基因载体

? ?

基本原理

重组DNA技术与医学的关系

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一、重组DNA技术相关概念
(一) DNA克隆
克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。

获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning), 即无性繁殖。

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技术水平:分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆 细胞克隆

个体克隆(动物或植物)

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DNA克隆 应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传 物质(同源的或异源的、原核的或真核的、天然 的或人工的DNA)与载体DNA接合成一具有自我 复制能力的 DNA分子 —— 复制子 (replicon) ,继而 通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因 的转化子细胞,再进行扩增提取获得大量同一 DNA 分 子 , 也 称 基 因 克 隆 或 重 组 DNA

(recombinant DNA) 。
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基因工程(genetic engineering) —— 实现基

因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程,
又称重组DNA工艺学。 目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质)

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(二)工具酶
? ? ? ? ?

限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4 DNA连接酶 碱性磷酸酶

?
?

末端转移酶
Taq DNA聚合酶
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重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶 功 能

限制性核酸内切酶
DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ

识别特异序列,切割DNA
催化DNA中相邻的5?磷酸基和3?羟基末端之间形成磷酸 二酯键,使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 合成双链cDNA分子或片段连接 ② 缺口平移制作高比活探针 ③ DNA序列分析 ④ 填补3?末端


Klenow片段

又名DNA聚合酶I大片段,具有完整DNA聚合酶I的5??3? 聚合、3??5?外切活性,而无5??3?外切活性。常用于 cDNA第二链合成,双链DNA 3?末端标记等 合成cDNA ② 替代DNA聚合酶I进行填补,标记或DNA序列分析


反转录酶

多聚核苷酸激酶
末端转移酶 碱性磷酸酶

催化多聚核苷酸5?羟基末端磷酸化,或标记探针
在3?羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端磷酸基
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限制性核酸内切酶
定义 限制性核酸内切酶 (restriction 围切割双链DNA的一类内切酶。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G GATCC + CCTAG G

endonuclease,

RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周

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分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ (基因工程技术中常用Ⅱ型)

作用
与甲基化酶共同构成细菌的限制修 饰系统,限制外源DNA, 保护自身DNA。

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命名

Hin dⅢ
属 系 株

Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 序

第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写; 第二、第三个字母是该细菌的种名,用小写; 第四个字母代表株; 用罗马数字表示发现的先后次序。
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Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) GGATCC CCTAGG

切口 :平端切口、粘端切口

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HindⅡ

Bam HⅠ

GTCGAC CAGCTG

GGATCC CCTAGG

GTC GAC CAG + CTG

G + GATCC G CCTAG

平端切口

粘端切口
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同功异源酶 来源不同的限制酶,但能识别和切割 同一位点,这些酶称同功异源酶。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG BstⅠ GGATCC CCTAGG G GATCC + CCTAG G

GATCC G + G CCTAG
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同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同,但切割DNA后,产生相同的粘性末端, 称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配 伍未端(compatible end)。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG Bg lⅡ AGATCT TCTAGA

G + GATCC CCTAG G

A +GATCT A TCTAG

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(三)目的基因
? ?

cDNA (complementary DNA)
基因组DNA (genomic DNA)

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(四)基因载体
定义 为携带目的基因,实现其无性繁殖或 表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分 子。 常用载体

质粒DNA
噬菌体DNA

病毒DNA
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克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源 DNA序列被扩增而特意 设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector)

为使插入的外源 DNA序列可转录翻译成
多肽链而特意设计的载体称为表达载体。

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载体的选择标准

? ?

能自主复制; 具有两个以上的遗传标记物,便于重组体 的筛选和鉴定; 有克隆位点(外源DNA插入点),常具有 多个单一酶切位点,称为多克隆位点; 分子量小,以容纳较大的外源DNA。

?

?

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1. 质粒 (plasmid)

特点 能在宿主细胞内独立自主复制;带有某些 遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。
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2. 噬菌体(phage)
λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列(插入型,适用cDNA克隆) EMBL系列(置换型,适用基因组克隆)

M13噬菌体DNA改造系统(含lacZ基因)
M13mp系列

pUC系列

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3. 粘性质粒(cosmid)

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其他

酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 (如腺病毒,腺病毒相关病毒,逆转录病毒)

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二、重组DNA技术基本原理

基本原理

目的基因的获取

克隆载体的选择和构建
DNA导入受体菌

外源基因与载体的连接 重组体的筛选

克隆基因的表达

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以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程
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(一)目的基因的获取
1. 化学合成法 要求:已知目的基因的核苷酸序列或其产物的 氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library)

4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) (见第22章)
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* 化学合成法获取目的基因

由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
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组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶

* 从基因组DNA文 库获取目的基因

基因片断
克隆载体 基因组DNA文库 存在于转化细胞内

重组DNA分子
受体菌

由克隆载体所携带的所
有基因组DNA的集合

含重组分子的转化菌

限制酶切位点
cos L

R cos

真核生物染 色体DNA

限制酶消化
cos L 左臂

限制酶部分消化

除去中间片段

R cos 右臂

~20 Kb DNA 片段

外源DNA与载体DNA混合
cos L ~20 Kb 外源 DNA 片段 R cos

连接反应 体外包装
用重组噬菌体 感染大肠杆菌

基因文库

用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库

从cDNA文库获取目的基因

mRNA
反转录酶

AAAA

逆转录酶
AAAA TTTT

cDNA
复制

碱水解
TTTT

双链cDNA
载体

DNA聚合酶Ⅰ

重组DNA分子
受体菌 SI核酸酶

cDNA文库

(二)克隆载体的选择和构建 (三)外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接
方式:(1)同一限制酶切位点连接
(2)不同限制酶切位点连接

配伍末端连接
非配伍末端连接
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同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接

GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG

Bam HⅠ切割反应

GATCC G

载体DNA用Bam HⅠ切割

+

GATCC G GATCC G

GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG

GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG

T4 DNA连接酶 15? C

载体自连

重组体

目的基因自连

GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG

不同限制酶切位点(非配伍末端)的连接
Eco RⅠ切割位点
GAATTC CTTAAG

Bg lⅡ切割位点
AGATCT TCTAGA

GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA

EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
AATTC G A TCTAG

AATTC G GATCT A

Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切

+

AATTC G

A TCTAG

T4 DNA连接酶 15? C
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA

重组体

配伍末端的 连接情况和同一 限制酶切位点连 接相似。

2. 平端连接
适用于:限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端

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目的基因 载体
限制性内切酶
限制性内切酶

T4 DNA连接酶 15? C

重组体

载体自连

目的基因 自连

3. 同聚物加尾连接
在末端转移酶(terminal transferase)的作 用下,在DNA片段末端加上同聚物序列、 制造出粘性末端,再进行粘端连接。

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目的基因
5? 3? 5? 限制酶或机械剪切 3? 5? λ-核酸外切酶 5? 末端转移酶 + dATP A(A)nA3? 5? 3? 5? 3? 5?

载体DNA
限制酶 3? 5? λ-核酸外切酶 5? 末端转移酶 + dTTP T(T)nT3? 5? 3?

3?

3?

3? A(A)nA

5?

3? T(T)nT

5?

T4 DNA连接酶 15? C

重组体

4. 人工接头(linker)连接
由平端加上新的酶切位点,再用限制酶切
除产生粘性末端,而进行粘端连接。

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人工接头及其应用
Eco RⅠ

Eco RⅠ Eco RⅠ

Eco RⅠ 5?- CCGAATTCG 3?- GGCTTAAGC
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(四)重组DNA导入受体菌
受体菌条件

安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷
处于感受态(competent)

导入方式
转化 (transformation)

转染 (transfection)
感染 (infection)
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(五)重组体的筛选 1. 直接选择法
(1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹

2. 免疫学方法
如免疫化学方法及酶免检测分析等
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抗 药插 性入 标失 记活 选法 择

( )

α互补

α 互 补 的 检 测

原 位 杂 交

Southern印迹

鸡的β肌球蛋白的克隆和检出





重组DNA技术操作过程可形象归纳为 分 切 接 转 筛 分离目的基因 限制酶切目的基因与载体

拼接重组体 转入受体菌 筛选重组体
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重组DNA技术操作的主要步骤
载体
质粒 噬菌体 病毒

目的基因(外源基因)
基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物

开环载体DNA

限制酶消化 连接酶

目的基因

转化 体外包装,转染

重组体

带重组体的宿主
筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交

(六)克隆基因的表达

表达体系的建立

表达载体的构建
受体细胞的建立 表达产物的分离纯化

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1. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用)
标准:选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足 不宜表达真核基因组DNA; 不能加工表达的真核蛋白质; 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) ; 很难表达大量可溶性蛋白
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大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌

2. 真核表达体系

酵母、昆虫、乳类动物细胞

优点:可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点:操作技术难、费时、经济 转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程 方法:磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射
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表达载体pFASTBACI 的物理图谱

三、重组技术与医学的关系
(一)疾病基因的发现与克隆
根据基因定位克隆之并研究其性质,而认 识疾病的分子机制。

(二)生物制药

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重组DNA医药产品
产 血液因子VIII 品 抗凝 促进凝血 功 能 组织胞浆素原激活剂

颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子
促红细胞生成素 生长因子(bFGF, EGF) 生长素 胰岛素

剌激白细胞生成
剌激红细胞生成 刺激细胞生长与分化 治疗侏儒症 治疗糖尿病

干扰素(? 1b, ?2a, ? 2b, ?)
白细胞介素 超氧化物歧化酶 单克隆抗体

抗病毒感染及某些肿瘤
激活、剌激各类白细胞 抗组织损伤 利用其结合特异性进行诊断试验、肿 瘤导向治疗

乙肝疫苗(CHO, 酵母)
口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗

预防乙肝
预防霍乱
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(三)基因诊断
基因诊断 (genetic diagnosis)是利用分子生 物学及分子遗传的技术和原理,在 DNA 水平

分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失
或插入等突变。 基本过程

分离、扩增待测的DNA片断 区分或鉴定DNA的异常
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标准 . 能正确扩增靶基因; . 能准确区分单个碱基的差别; . 本底或噪声低,不干扰DNA的鉴定;

. 便于完全自动化操作,适合大面积、
大人群普查。

Dr.Qiang Fu. Dept.of Biochemistry & Molecular Biology, Preclinical Medicine School, SCU, 2014. 12

(四)基因治疗
定义 基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷 的细胞补充相应功能的基因,以纠正或补偿 其基因的缺陷,从而达到治疗的目的。

方式 体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy)
性细胞基因治疗 (germ line gene therapy)

Dr.Qiang Fu. Dept.of Biochemistry & Molecular Biology, Preclinical Medicine School, SCU, 2014. 12

(五)遗传疾病的预防
1. 产前诊断 2. 携带者测试 3. 症候前诊断 4. 遗传病易感性

Dr.Qiang Fu. Dept.of Biochemistry & Molecular Biology, Preclinical Medicine School, SCU, 2014. 12


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